Меню

Техника посева шпателем дригальского



Техника посева микроорганизмов на питательные среды

Посев уколомосуществляется уколом микробиологической петлёй или иглойв столбик плотной или полужидкой питательной среды. Применяется для выращивания анаэробов, для выявления характера роста по ходу укола и для определения газообразования. У подвижных и неподвижных микроорганизмов характер роста будет различным. Посев уколом практикуют также для длительного хранения культур.

Посев петлей (посев штрихами) по методу Гольда.На внешней стороне дна чашки Петри с питательным агаром проводят разграничительные линии, разделяющие её на 4 сектора. Исследуемый материал вносят петлёй в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлёй, не изменяя её положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток микроорганизмы вырастают в виде отдельных колоний.

Посев шпателем по методу Дригальского.Используют 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлёй или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель, не обеззараживая, переносят во 2-ю чашку и втирают оставшиеся на нём микроорганизмы в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на третьей или на второй и третьей чашках вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры.

Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду свежескошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая материал из верхнего края роста культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно выделить чистую культуру.

Дата добавления: 2015-08-04 ; просмотров: 2630 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

Посев по методу Дригальского

Список практических навыков

Приготовление фиксированного мазка

Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и равномерно распределяют ее по поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки. Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько 3 раз через пламя горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом (спиртами, смесью Никифорова и т.д.).

Окраска фиксированного мазка простым методом

Фиксированный мазок помещают на «салазки» в кювету, дают ему остыть и наносят на него пипеткой несколько капель красителя на 2-3 мин. Затем смывают водой и высушивают препарат фильтровальной бумагой.

3. Окраска фиксированного мазка по методу Грама:

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель — генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.

2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.

4. Промыть водой.

5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.

6. Промыть водой, высушить.

4. Питательные среды:

Среда Эндо — плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.

Состав: МПА — питательная основа; лактоза — дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом — индикатор на РН.

Принцип работы среды — если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда Плоскирева — плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.

Состав: МПА — питательная основа; соли желчных кислот — элективный фактор; лактоза — дифференциальный фактор; нейтральный красный — индикатор на РН.

Принцип работы среды — соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже — через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда ЖСА (желточно-солевой агар)— плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.

Состав: МПА — питательная основа; 10%NaCl — элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.

Принцип работы среды — 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.

Посев по методу Дригальского

Посев производится на трех занумерованных чашках Петри (I, II, III) с питательной средой. Для посева используются шпатели, завернутые в бумагу и простерилизованные.

1. На поверхность питательной среды в чашке I наносят петлей й каплю исследуе­мого материала и растирают ее стерильным шпателем по всей поверхности питательной среды.

2. Вынимают шпатель из чашки I, закрывают ее и быстро переносят шпатель в чашку II, не прожигая его. Расти­рают материал по всей поверхности среды. Чашку II закрывают.

3. Так же переносят шпатель в чашку III и растирают мате­риал по поверхности питательной среды . Закрывают чашку. Шпатель опускают в дезинфицирующую жидкость.

4. Чашки надписывают (название материала, фамилия больного, дата) и помещают в термостат .Чашки находятся в термостате 18—24 часа.

6. Определение биохимических свойств микробов:

Сахаролшпические свойства изучают на средах Гисса.

Среды Гисса — жидкие сложные питательные среды, по классификации сред относятся к дифференциальным

Состав: ПВ — питательная основа; углевод — дифференциальный фактор; индикатор Андреде — индикатор на РН. В пробирку, содержащую глюкозу, помещен «поплавок» — маленькая перевернутая пробирка. Среды до посева соломенно-желтого цвета.

Принцип работы среды — если засеянная в среду культура расщепляет соответствующий углевод, цвет среды меняется на красный, так как среда закисляется. Глубина расщепления углеводов оценивается по глюкозе, при расщеплении которой видно не только закисление по покраснению среды, но и газообразование, которое видно в виде пузырька газа в «поплавке».

Протеолитические свойства — на пептонной воде. Для определения глубины расщепления белка под пробки помещены: лакмусовая бумага (посинеет при образовании NH3); фильтровальная бумага, смоченная уксуснокислым свинцом (почернеет при образовании H2S); реактив Эрлиха добавляют для определения индола (среда, содержащая индол покраснеет).

7. Определение чувствительности к антибиотикам методом стандартных дисков:

Исследуемую культуру засевают газоном на чашку Петри с плотной питательной средой (чаще всего на МПА). На засеянную поверхность среды сразу же раскладывают (не более 6 на чашку) стандартные бумажные диски, содержащие антибиотики (30 мкг). Каждый диск маркирован тремя буквами от названия соответствующего антибиотика. Засеянные чашки помещают в термостат. Через 24 часа учитывают результат, измеряя диаметр зоны задержки роста. Чувствительность культуры к антибиотику определяют по таблице, но ориентировочно можно считать: до 12 мм — устойчив, до 20 – умеренно устойчив, более 20 — чувствителен.

Читайте также:  За сколько вырастает рассада капусты

8. Качественная проба на бактериофаг по Отто:

На чашку Петри с МПА газоном засевают известную культуру (например Е. coli), затем наносят каплю фильтрата, содержащую неизвестный бактериофаг, дают ей стечь по поверхности засеянного МПА. Чашку помещают в термостат. Через 24 часа учитывают результат. Если по ходу стекающей капли культура не выросла, образовалась «стерильная дорожка», значит в фильтате содержался бактериофаг, лизирующий данную культуру (в нашем случае — колифаг).

9. Фаготипирование стафилококков:

Дно чашки Петри с МПА делят на квадраты, каждый из которых подписывают цифрами, соответствующими номерам типовых стафилофагов. На подготовленную чашку газоном засевают исследуемый штамм S.aureus и в каждый квадрат капают соответствующий типовой стафилофаг. Засеянную чашку с культурой и бактериофагами помещают в термостат. На другой день учитывают результат фаготипирования, отмечая номера типовых стафилофагов, лизировавших культуру (в соответствующих квадратах будут видны «стерильные пятна»). Фаготип — перечень типовых бактериофагов, лизировавших данную культуру. Это — один из приемов внутривидового типирования, позволяющий установить источник инфекции и пути распространения.

10. Титрование вируса полиомиелита в цветной пробе Солка:

В пробирках находится вируссодержащий материал в соответствующих разведениях и культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

В контрольной пробирке содержится только культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

Штатив помещают в термостат. Просматривают ежедневно. После того как в контрольной пробирке цвет среды изменится с красного на желтый, что свидетельствует о том, что культура клеток жива, штатив извлекают из термостата и учитывают результат. Титром вируса является наибольшее разведение, в которой произошла гибель клеток и цвет среды поэтому не измененился, остался красным.

Источник

Посев по методу Дригальского

Посев производится на трех занумерованных чашках Петри (I, II, III) с питательной средой. Для посева используются шпатели, завернутые в бумагу и простерилизованные.

1. На поверхность питательной среды в чашке I наносят петлей й каплю исследуе­мого материала и растирают ее стерильным шпателем по всей поверхности питательной среды.

2. Вынимают шпатель из чашки I, закрывают ее и быстро переносят шпатель в чашку II, не прожигая его. Расти­рают материал по всей поверхности среды. Чашку II закрывают.

3. Так же переносят шпатель в чашку III и растирают мате­риал по поверхности питательной среды . Закрывают чашку. Шпатель опускают в дезинфицирующую жидкость.

4. Чашки надписывают (название материала, фамилия больного, дата) и помещают в термостат .Чашки находятся в термостате 18—24 часа.

6. Определение биохимических свойств микробов:

Сахаролшпические свойства изучают на средах Гисса.

Среды Гисса — жидкие сложные питательные среды, по классификации сред относятся к дифференциальным

Состав: ПВ — питательная основа; углевод — дифференциальный фактор; индикатор Андреде — индикатор на РН. В пробирку, содержащую глюкозу, помещен «поплавок» — маленькая перевернутая пробирка. Среды до посева соломенно-желтого цвета.

Принцип работы среды — если засеянная в среду культура расщепляет соответствующий углевод, цвет среды меняется на красный, так как среда закисляется. Глубина расщепления углеводов оценивается по глюкозе, при расщеплении которой видно не только закисление по покраснению среды, но и газообразование, которое видно в виде пузырька газа в «поплавке».

Протеолитические свойства — на пептонной воде. Для определения глубины расщепления белка под пробки помещены: лакмусовая бумага (посинеет при образовании NH3); фильтровальная бумага, смоченная уксуснокислым свинцом (почернеет при образовании H2S); реактив Эрлиха добавляют для определения индола (среда, содержащая индол покраснеет).

7. Определение чувствительности к антибиотикам методом стандартных дисков:

Исследуемую культуру засевают газоном на чашку Петри с плотной питательной средой (чаще всего на МПА). На засеянную поверхность среды сразу же раскладывают (не более 6 на чашку) стандартные бумажные диски, содержащие антибиотики (30 мкг). Каждый диск маркирован тремя буквами от названия соответствующего антибиотика. Засеянные чашки помещают в термостат. Через 24 часа учитывают результат, измеряя диаметр зоны задержки роста. Чувствительность культуры к антибиотику определяют по таблице, но ориентировочно можно считать: до 12 мм — устойчив, до 20 – умеренно устойчив, более 20 — чувствителен.

8. Качественная проба на бактериофаг по Отто:

На чашку Петри с МПА газоном засевают известную культуру (например Е. coli), затем наносят каплю фильтрата, содержащую неизвестный бактериофаг, дают ей стечь по поверхности засеянного МПА. Чашку помещают в термостат. Через 24 часа учитывают результат. Если по ходу стекающей капли культура не выросла, образовалась «стерильная дорожка», значит в фильтате содержался бактериофаг, лизирующий данную культуру (в нашем случае — колифаг).

9. Фаготипирование стафилококков:

Дно чашки Петри с МПА делят на квадраты, каждый из которых подписывают цифрами, соответствующими номерам типовых стафилофагов. На подготовленную чашку газоном засевают исследуемый штамм S.aureus и в каждый квадрат капают соответствующий типовой стафилофаг. Засеянную чашку с культурой и бактериофагами помещают в термостат. На другой день учитывают результат фаготипирования, отмечая номера типовых стафилофагов, лизировавших культуру (в соответствующих квадратах будут видны «стерильные пятна»). Фаготип — перечень типовых бактериофагов, лизировавших данную культуру. Это — один из приемов внутривидового типирования, позволяющий установить источник инфекции и пути распространения.

10. Титрование вируса полиомиелита в цветной пробе Солка:

В пробирках находится вируссодержащий материал в соответствующих разведениях и культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

В контрольной пробирке содержится только культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

Штатив помещают в термостат. Просматривают ежедневно. После того как в контрольной пробирке цвет среды изменится с красного на желтый, что свидетельствует о том, что культура клеток жива, штатив извлекают из термостата и учитывают результат. Титром вируса является наибольшее разведение, в которой произошла гибель клеток и цвет среды поэтому не измененился, остался красным.

Серологические реакции

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Источник

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Читайте также:  Горох с овсом посев

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – «зеркало». Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

  • При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
  • При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

  • • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
  • • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

  • Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 «С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
  • Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
  • Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний» (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

Читайте также:  Когда взойдет рассада капусты

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

  • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

  • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Источник