Посев культур методом штриха

Методы выделения чистой культуры

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду (МПА), поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

2) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

3) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

4) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рисунок 4.2, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рисунок 4.2, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рисунок 4.2), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рисунок 4.2). Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

Рисунок 4.2 – Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний

Последовательные разведения в твердой среде– самый простой способ посева по чашкам, который заключается в том, что после инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром, среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15–20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара.

Источник

Посев штрихом

Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки»), но лишь некоторые из них почти всегда дают изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках. При работе с анаэробами «штрихованные чашки» или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накопления растворенного кислорода.

В Г Д

Рис. 6. Удобный метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний. А. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того, чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху)

Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43—45°С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Дата добавления: 2014-12-06 ; просмотров: 2300 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

БИОЛОГИЯ Том 2 — руководство по общей биологии — 2004

12. МИКРОБИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

12.4. Методы инокуляции

Во избежание загрязнения при введении небольшого количества микроорганизмов в питательную среду — инокуляции (или посева) — необходимо использовать асептические методы. Процедуры посева различаются в зависимости от типа среды (жидкой или твердой).

12.4.1. Посев на твердую среду

Посев штрихом, или посев разведением

Метод представлен на рис. 12.4. Он применяется для выделения чистых колоний бактерий из смеси бактерий. Для посева используют проволочную петлю, которую сначала нужно прокалить, как показано на рис. 12.4,А, чтобы простерилизовать. Затем с помощью петли берут тонкую пленку жидкой суспензии или небольшое количество твердого материала, содержащего исследуемые микроогранизмы, из предварительно выращенной культуры или другого источника микроорганизмов. Петлей мягко проводят по поверхности среды, делая серии штрихов. После каждой серии штрихов чашку немного поворачивают, так чтобы в каждой новой серии распределялись бактерии из предыдущей серии штрихов, истощая таким образом штрихи до отдельных бактерий (рис. 12.4). (Не надейтесь что-нибудь увидеть на финальных штрихах до окончания времени инкубации!) Когда метод отработан, штрихи можно делать очень быстро.

С помощью этого метода можно выделять бактерии из естественных мест обитания, например из почвы, молока, воды. Образцы твердых субстанций, таких как почва, лучше суспендировать в небольшом количестве воды, либо предварительно проинкубировать в жидкой среде. Безопасным источником для рутинной работы является пастеризованное молоко. Перед тем как проводить эксперименты с бактериями или грибами, следует ознакомиться с инструкциями и правилами безопасности, чтобы снизить до минимума риск культивирования вредных организмов.

Рис. 12.4. Посев штрихом, или разведение культуры.

Посев на поверхность агара

Этот метод проиллюстрирован на рис. 12.5. Он удобен для посева микроорганизмов из жидкой суспензии на твердую среду. Метод применяется для определения числа жизнеспособных клеток в пробе после серийных разведений (см. разд. 12.6.1). Его можно использовать также для получения сплошного «газона» микроорганизмов на поверхности агара после густого посева. Это удобно при анализе активности ингибиторов, таких как антибиотики или дезинфицирующие вещества, которые добавляют в сделанные в агаре углубления либо наносят на диски из фильтровальной бумаги, размещенные на поверхности агара. Ингибитор диффундирует через агар, образуя зону подавления роста вокруг отверстий или дисков фильтровальной бумаги, которая видна после инкубации. Диаметр зоны может служить мерой степени ингибирования.

Рис. 12.5. Посев на поверхность агара.

Этот метод, альтернативный методу посева на поверхность агара, используется для инокуляции клеток из жидкой культуры, а также для подсчета жизнеспособных клеток. Поскольку клетки распределены по всей среде, а не только по поверхности агара, можно подсчитать гораздо большее их количество — до 1000 колоний на чашку. Однако размеры выросших колоний значительно меньше (рис. 12.6).

Определенный объем (до 0,5 см 3 ) клеточной суспензии вносят в подходящий объем (около 15—20 см 3 ) простерилизованного расплавленного в небольшом флаконе питательного агара, который предварительно был охлажден до 45—50 °С в водяной бане. Снимают крышку и перед добавлением клеточной суспензии прожигают горлышко флакона, как показано на рис. 12.3, A и Б. Суспензию клеток тщательно перемешивают с питательным агаром, поворачивая (не встряхивая) назад и вперед зажатый в ладонях флакон (рис. 12.6, А). Затем выливают смесь в стерильную чашку Петри, как показано на рис. 12.3, В. Подписывают донышко чашки и инкубируют ее. После инкубации чашка выглядит, как показано на рис. 12.6, Б.

Рис. 12.6. Посев заливкой.

Метод используют для культивирования анаэробных организмов или организмов, растущих при низкой концентрации кислорода (микроаэрофилов). Обычно используют пробирку с питательной агаризованной средой. Благодаря небольшой поверхности и достаточно большой глубине агара в пробирке по сравнению с чашкой доступ кислорода внутрь агара ограничивается. Посев производят прямой проволочкой (без петли), или бактериологической иглой. Небольшое количество культуры (твердой или жидкой) берут кончиком иглы и затем вертикально прокалывают ею агар (рис. 12.7). Культура растет в агаре во все стороны от линии прокола.

Рис. 12.7. Посев уколом.

Биологическая библиотека — материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.

Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.

Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.

Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.

Источник

Метод посева истончающим штрихом. Результат.

Рассмотрим один из наиболее часто применяемых на практике.

Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактерио-

логической петлей и наносят на поверхность питательной среды воз-

ле края чашки. Прокаливают петлю, удаляя тем самым избыток мате-

риала, и проводят посев параллельными штрихами от края к краю

чашки. Так повторяют еще два раза (рис. 14).

Рис. 14. Метод посева истончающим штрихом

Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре

на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов

Рис. 15. Метод посева истончающим штрихом. Результат

Метод штрихов

Для получения изолированных колоний можно использовать

посев тампоном, которым проводили забор исследуемого материала.

Несколько приоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят

туда тампон и осторожными движениями втирают материал в по-

верхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластин-

чатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заклю-

чается в том, что они создают изолированные колонии микроорга-

низмов, которые при инокуляции на другую питательную среду

превращаются в чистую культуру.

II. Выделение чистых культур

Выделение чистых культур из намеченных колоний для даль-

нейшего изучения происходит с использованием комбинированных

сред для первичной идентификации.

Выделение чистой культуры аэробных

Источник

Посев штрихом

В Г Д

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху)

Выделение чистой культуры по способу Дригальского

Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Источник