Меню

Посев газоном микробиология это



Методика посева «газоном».

Ориентировочная карта основ действий

Практического занятия №8.

Тема: «Посев культур микроорганизмов и биологического материала на питательные среды».

План:

Обучение технике посева микроорганизмов и исследуемого материала на жидкие, полужидкие и плотные питательные среды:

а) бакт. петлей на плотную питательную среду в чашку Петри;

б) бакт. петлей на сектора плотной питательной среды в чашку Петри;

в) бакт. петлей на скошенную поверхность плотной питательной среды;

г) бакт. петлей методом укола в глубину столбика полужидкой питательной среды;

д) бакт. петлей в жидкую питательную среду в пробирку;

е) бакт. петлей на поверхность плотной питательной среды методом «бляшки»;

ж)тампоном в жидкую и плотные питательные среды;

з)шпателем на плотную питательную среду;

и)пипеткой методом «газона».

Задание № 1.

Ознакомьтесь с инструкцией для проведения практического занятия.

Задание № 2.

Изучите общие правила посева исследуемого материала на питательные среды:

1. Бактериологические посевы — это манипуляции, включающие нанесение (внесение) петлей, пипеткой или другим инструментом содержащего бактерии материала на (в) питательные среды с целью выделения чистой культуры, ее накопления, хранения, определения многообразных свойств. Посевы должны проводиться таким образом, чтобы достигнуть поставленной цели (например, получение изолированных колоний) и в то же время предупредить возможность контаминации посевного материала и питательных сред микробами окружающей среды, а также заражения людей и контаминации окружающих объектов микробами, находящимися в посевном материале.

2. Посевы бактериологические производят в спецодежде, в специальных боксах и лабораториях, содержащих минимальное число микробов, около пламени горелки, стерильными инструментами в стерильные среды и при строгом соблюдении других условий асептики.

3. Перед проведением посевов необходимо оборудовать рабочее место, добавив к стационарному оборудованию исследуемый материал, инструменты, питательные среды, которые предварительно подписывают (номер исследуемого материала и дату посева).

Задание № 3.

Изучите технику посева с помощью бактериальной петли на плотную питательную среду в чашку Петри:

1. Пробирку с посевным материалом держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами.

2. В правой руке держат бактериальную петлю, как писчее перо, и стерилизуют ее в пламени спиртовки.

3. Четвертым и пятым пальцами и краем ладони правой руки вынимают из пробирки пробку.

4. Края пробирки обжигаютв пламени спиртовки.

5. Прокаленную петлю вводят через пламя спиртовки в пробирку с посевным материалом, охлаждают петлю о внутреннюю стенку пробирки, (или погружая ее в конденсационную жидкость) и, набрав немного материала (одну петлю), осторожно вынимают из пробирки со средой, не касаясь ее стенок и краев.

6. Удерживая чашку Петри со стерильной питательной средой на ладони левой руки, слегка приоткрываем ее крышку большим пальцем.

7. Вводим петлю с посевным материалом под крышку и делаем штрихообразные движения петлей, начиная от края чашки и заканчивая на расстоянии 2 см, — площадка для сброса материала.

8. В месте окончания штриха агар прокалываем петлей, снимая избыток материала, и далее засеваем оставшуюся поверхность агара штрихообразными движениями от одного края чашки к другому.

9.Чашку закрываем. Петлю прожигаем.

Задание № 4.

Сделайте посев чистой культуры микробов петлей «штрихами»на 4 сектора чашки Петри с средами Эндо, Левина, предварительно разделив чашку на 4 сектора, (проведя со стороны дна чашки стеклографом две взаимно-перпендикулярных линии) и подписав чашку.

Внимание!Все надписи на чашках Петри делают со стороны дна!

1. Прожигаем петлю.

2. Удерживая чашку Петри со стерильной питательной средой на ладони левой руки, слегка приоткрываем ее крышку большим пальцем.

3. Вводим петлю под крышку чашки, остуживая ее о внутреннюю стенку чашки Петри.

4. Забираем петлей часть изолированной колонии. Чашку закрываем.

5. Вносим посевной материал на поверхность стерильной питательной среды в 1 сектор, приоткрыв крышку чашки Петри. Петлей делаем штрихообразные движения в направлении от периферии к центру сектора.

6. Повторяем п.5 при посеве в каждом секторе. Движения по секторам производятся по часовой стрелке.

7. Чашку закрываем. Петлю прожигаем.

Изучите технику посева бульонной культуры бактериальной петлей на 2 сектора плотной питательной среды в чашке Петри

Методика посева та же, что и при выполнении задания № 4 (посев на 4 сектора), только при посеве на 2 сектора чашку не расчерчивают, а засевают материал на поверхность половины среды параллельными штрихами, затем чашку поворачивают и посев второй половины среды делают перпендикулярно уже совершенному посеву.

Внимание!При посеве бульонной культуры (или жидкого материала) петлей избыток материала не снимается!

Задание № 6.

Сделайте посев культуры бактерий петлей на 2 сектора плотной питательной среды в чашке Петри

Изучите технику посева бактериальной петлей на скошенный МПА.

На чашке Петри с плотной питательной средой отбирают типичную изолированную колонию, обводя ее стеклографом со стороны дна чашки.

1. Чашку Петри берут в левую руку, а петлю — в правую; петлю фламбируют в пламени спиртовки; открывают крышку чашки и вводят туда обожженную петлю, охлаждают ее о внутреннюю поверхность крышки; набирают посевной материал (не более части колонии).

2. Вынимают петлю, закрывают чашку и ставят ее в кювету, а в левую руку берут пробирку со скошенной средой.

3. Вынимают пробку, обжигают края пробирки, вводят петлю с материалом в пробирку до конденсата и делают посев по поверхности среды зигзагообразными движениями снизу вверх, начиная от границы конденсата.

4. Петлю выводят из пробирки, обжигают ее края и закрывают пробкой, затем фламбируют петлю.

Задание № 8.

Сделайте посев культуры бактерий, выращенной на пластинчатой среде в чашке Петри, на скошенный МПА, предварительно подписав пробирку со средой.

Изучите технику посева бактериальной петлей методом «укола» в столбик полужидкой (плотной) среды.

1. См. пункты 1 задания № 7.

2.Вынимают петлю, закрывают чашку и ставят ее в кювету, а в левую руку берут пробирку со средой, залитой «столбиком».

3. Открывая пробирку, правой рукой зажимают пробку , и обжигают горлышко пробирки.

4. При посеве «уколом» бактериальной петлей с посевным материалом делают прокол среды с поверхности, не доходя 3-4 мм до дна пробирки.

5. Петлю извлекают, горлышки пробирок прожигают в пламени горелки. Пробирки закрывают пробками.

Пробирку рекомендуется держать дном вверх, чтобы не наступила контаминация среды воздушной микрофлорой.

Задание №10.

Сделайте посев чистой микробной культуры на среду Гисса, предварительно подписав пробирку со средой.

Задание №11.

Изучите технику посева с помощью бактериальной петли из пробирки в пробирку:

1. Пробирку с посевным материалом и пробирку со средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне, а их основания находились поверх кисти. Обычно пробирку с посевным материалом держат ближе к себе.

2. В правой руке держат бактериальную петлю, как писчее перо, и стерилизуют ее в пламени спиртовки (горелки) трехкратно.

3. Четвертым и пятым пальцами и краем ладони правой руки вынимают из пробирок обе пробки одновременно.Извлекают пробки не рывком, а плавно: легкими винтовыми движениями.

4. Вынув пробки, края, пробирок обжигаютв пламени спиртовки.

Читайте также:  Когда происходит созревание семян у ели

5. Прокаленную петлю вводят через пламя спиртовки в пробирку с посевным материалом (культурой), охлаждают петлю о внутреннюю стенку пробирки, (или погружая ее в конденсационную жидкость) и, набрав немного материала (одну петлю), осторожно переносят в пробирку со средой, не касаясь стенок и краев пробирок.

6. При посеве в жидкую среду петлю с посевным материалом слегка погружают в жидкость (бульон), материал растирают на стенке пробирки и смывают средой.

7. После посева петлюизвлекают из пробирки, края пробирок обжигают и, проведя пробки через пламя спиртовки, закрывают пробирки; после этого прокаливают петлю.

1.Не забывайте выполнять правила личной безопасности при работе с заразным материалом.

2. Следите, чтобы жидкая среда, не вылилась и не смочила пробку!

Задание №12.

Сделайте посев чистой культуры кишечной палочки в пробирку с МПБ, предварительно подписав пробирку с МПБ (ниже уровня пробирки написать регистрационный номер и дату посева).

Задание № 13.

Изучите технику посева бактериальной петлей методом «бляшки»

См.1-4-ый пункты задания № 11.

1. Прокаленную петлю вводят через пламя спиртовки в пробирку с посевным материалом (культурой), охлаждают петлю о внутреннюю стенку пробирки, (или погружая ее в конденсационную жидкость) и, набрав немного материала (одну петлю), осторожно переносят в чашку со средой.

2.Петлю с посевным материалом вводят под крышку чашки Петри и, слегка прижав ее к поверхности среды, делают круговые движения до тех пор, пока диаметр «бляшки» составит 0,8-1,0 см.

3.Отступив 1,5 см от сделанной «бляшки» и повернув петлю другой стороной (поверхностью), аналогично засевают вторую «бляшку».

Внимание! С одной петли можно засеять только 2 «бляшки»!

Задание № 14.

Сделайте посев чистой культуры на сектор чашки Петри с МПА петлей методом «бляшки».

Задание № 15.

Изучите метод посева исследуемого материала шпателем.

1. Берут стерильный шпатель.

2. Стерильной стеклянной палочкой или петлей извлекают материал из пробирки, фламбируя края пробирки до забора материала и после. Пробирку ставят в штатив.

3. Левой рукой слегка приоткрывают крышку чашки Петри со средой Эндо и переносят посевной материал с палочки (петли) на поверхность среды, чашку закрывают, продолжая держать в руке.

4. Правой рукой берут стерильный шпатель.

5. Открыв чашку, подводят шпатель к капле материала так, что бы она растеклась по ребру шпателя.

6. Материал тщательно втирают круговыми движениями по всей поверхности питательной среды, а левой рукой при этом удерживают крышку и одновременно вращают чашку.

7. По окончании посева шпатель вынимают из чашки и закрывают крышку. Шпатель помещают в дез. раствор. Посевы инкубируют при 37°C 24 часа.

Задание №16.

Отработайте технику проведения посева патологического материала (испражнений в глицериновой смеси) шпателем на чашку Петри со средой Эндо или Левина.

Задание № 17.

Изучите технику посева исследуемого материала тампоном на плотную питательную среду в чашку Петри.

1. Осторожно, не касаясь горлышка пробирки, извлекают из нее тампон с материалом.

2. В правой руке удерживают пробирку с тампоном, в левой руке — чашку Петри.

3. Приоткрыв чашку, вводят на поверхность агара тампон, делая им штрихообразные движения у края агара. Это так называемая площадка для сброса материала.

4.Чашку закрывают. Тампон помещают в дез. раствор.

5. Материал, оставленный на площадке для сброса, распределяют штрихообразными движениями стерильной петлей или ребром шпателя по оставшейся части агара.

6. Чашку закрывают. Петлю фламбируют (шпатель погружают в дез. раствор).

Задание №18.

Отработайте технику проведения посева патологического материала тампоном.

Задание № 19.

Изучите метод посева исследуемого материала «газоном».

Методика посева «газоном».

1. 1 мл. жидкой культуры (если культуру берут с плотной среды- ее эмульгируют в стерильном физиологическом растворе, вносят последний в количестве 5-7 мл. в пробирку с культурой) наносят на поверхность агара в чашку Петри при помощи стерильной пипетки (микробную культуру всасывают с помощью груши).

2. Тщательно распределяют жидкость на поверхности среды, слегка покачивая чашку Петри в руках или вращая ее по столу.

3. Затем чашку слегка отклоняют от себя и этой же пипеткой, которой вносили культуру в чашку, отсасывают избыток культуры, выливая его в дезинфицирующий раствор, туда же помещают и пипетку.

4. Посев «подсушивают» в термостате, приоткрыв чашку Петри, в течение 10-15 минут, затем чашку закрывают, переворачивают вверх дном и инкубируют при 37°C 24 часа.

Примечание: Посев «газоном» используется при:

1. постановке пробы чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с помощью бумажных дисков;

2. обнаружении фага на плотных питательных средах (фагодиагностика и фаготипирование).

Задание № 20.

Отработайте технику проведения посева «газоном», взяв в качестве материала бульонную культуру микроорганизмов.

Задание № 21.

Поставьте все чашки Петри и пробирки в штативе со сделанными посевами в термостат для инкубации при + 37°С на 24 часа.

Внимание! Чашки Петри с посевами ставят в термостат вверх дном и не более 2-3 чашек одна на другую, (чтобы обеспечить равномерный прогрев посевов)!

Задание № 22.

Запишите в дневник методики посевов.

Задание № 23.

Заполните таблицу: укажите известные вам способы посева и применяемые при этом инструменты.

методы посева на среды
в чашках Петри в пробирках
со скошенным агаром в столбик агара с бульоном со средой, залитой столбиком и «косяком»

Вопросы для закрепления

1. Каковы общие правила посева исследуемого материала на питательные среды?

2. Расскажите о технике посева с помощью бактериальной петли из пробирки в пробирку.

3. Какова техника посева бактериальной петлей «штрихами» на 4 сектора плотной питательной среды в чашке Петри?

4. Расскажите о технике посева бульонной культуры бактериальной петлей на 2 сектора плотной питательной среды в чашке Петри.

5. Какова техника посева бактериальной петлей методом «укола» в столбик полужидкой (плотной) среды?

6. Как произвести посев культуры на сектор чашки Петри петлей методом «бляшки»?

7. Каковы условия инкубации бактерий — аэробов и бактерий — анаэробов?

8. Перечислите инструменты, используемые для посева материала в жидкие питательные среды.

9. Назовите инструменты, используемые для посева материала на плотные питательные среды.

10. Какие правила безопасности необходимо выполнять при посевах?

11. Как осуществляется метод посева «газоном»? Для чего он используется в практической медицине?

12. Расскажите о технике посева исследуемого материала шпателем. К какому методу посева (качественному или количественному) он относится?

13. Как называют методику посева исследуемого материала тампоном в бульон?

14. Расскажите о технике посева материала тампоном на плотную питательную среду в чашку Петри.

15. При каких перечисленных способах посева можно получить рост изолированных колоний?

16. Какие методы посева способствуют сплошному росту культуры на питательной среде?

Домашнее задание: Учебник Ф.К. Черкес, с. 107-109

Источник

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Читайте также:  Железный купорос полив почвы

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – «зеркало». Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

  • При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
  • При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

  • • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
  • • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

  • Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 «С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
  • Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
  • Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний» (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

Читайте также:  Как собрать семя укропа

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

  • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

  • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Источник