Бактериологические методы
В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 «О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений» подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.
При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 — 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения — возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.
Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.
Люминесцентная микроскопия
Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.
К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.
При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 — 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).
Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).
Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.
Рисунок 1
Микобактерии туберкулеза
а — метод окраски по Цилю-Нельсену
б — метод люминисцентной микроскопии
в — клетки Лангхаса
г — эпителиоидные клетки
Культуральный метод
Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это «золотой стандарт» бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.
Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, «Новая», Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 — 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.
Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.
Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.
Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования — от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.
Системы BACTEC
Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов — применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 — 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 — 14 суток.
Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, «погашенный» высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и «вручную», тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.
Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой — посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.
Посев на L -формы микобактерий
Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.
Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.
Источник
«Выявление микобактерий туберкулеза в материале»
Важное эпидемиологическое и клиническое значение имеет обнаружение микобактерий туберкулеза. Для этого используется различный материал, чаще всего мокрота. Лучше исследовать утреннюю мокроту, при незначительном её количестве рекомендуется собирать мокроту в течение суток. Однако немалая часть больных туберкулезом не выделяет мокроту, поэтому в специализированных учреждениях применяется исследование промывных вод трахеи и бронхов, бронхоальвеолярного смыва.
Широкое распространение должен иметь метод раздражающих ингаляций: 10-15% раствором поваренной соли на 2% растворе соды. Его можно применить везде, вплоть до сельского врачебного участка. Исследуются на МБТ также мазки из зева, моча, кал, выпот из полостей, спинномозговая жидкость, выделения из гениталий, отделяемое свищей, материал, полученный при пункциях и биопсиях, а также бронхоальвеолярный смыв (БАС), полученный при бронхоальвеолярном лаваже.
У больных ограниченными формами туберкулеза в БАС находили МБТ в 2,5 раза чаще, чем в мокроте, L-формы МБТ – также чаще. В последнее время доказана возможность выделения микобактерий из крови при выраженных формах туберкулеза, в том числе у детей и подростков. Используется ряд методов выявления микобактерий в материале.
Простая бактериоскопия мазка, окрашенного по Цилю-Нельсену в модификации ВОЗ . Мазок из материала фиксируется на пламени спиртовки или газовой горелки, затем окрашивается карболовым раствором фуксина, после чего обесцвечивается 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта, что приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Затем производится докрашивание 0,25% раствором метиленового синего. Микобактерии обнаруживаются в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек красного или розового цвета, иногда расположенных в виде римской цифры V.
Нередко в теле бактерии или отдельно обнаруживаются более темные зерна (зернистые формы) и др. формы изменчивости МБТ. В настоящее время при положительном результате бактериоскопии пишут – «обнаружены КУБ (кислотоустойчивые бактерии)», т. к. очень редко, но могут встречаться кислотоустойчивые сапрофиты, обычно в моче. При микроскопии мазка, проводимой в обычном микроскопе под иммерсионным объективом, согласно требованиям ВОЗ, необходим просмотр 100 полей зрения, а в некоторых случаях до 300 в течение не менее 10 минут, что повышает выявляемость и достоверность исследования.
В ряде развивающихся стран этот метод является основным при обследованиях на туберкулез. Однако он недостаточно чувствителен (до 10.000-20.000 микробных тел в 1 мл мокроты). Для повышения чувствительности используют методы флотации (применение суспензии материала с более легким, чем вода, углеводородом для всплывания на поверхность микобактерий и микроскопии флотационного кольца) или седиментации (центрифугирование и микроскопия осадка). Наиболее чувствительным является метод люминесцентной микроскопии, когда мазок окрашивается флюоресцирующими красками и микобактерии выглядят в виде светящихся точек в темном поле.
Большое значение имеет бактериологический метод, когда материал засевают на питательную среду и в случае роста культуры МБТ определяют ее чувствительность к противотуберкулезным препаратам. Обычно используются плотные яично-солевые питательные среды (жидкие и полужидкие применяются редко), т. к. на обычных средах микобактерии не растут. В качестве стандартной используется среда Левенштейна-Йенсена, а также её модификации (Гельберга, Финн-2, Аникина и др.).
В настоящее время в Гродненском медуниверситете изучается эффективность более дешевой плотной питательной среды (Кузнецов О.Е., Гельберг И.С.). При этом возможно выявление МБТ при наличии в 1 мл материала нескольких десятков особей. Изредка при низкой жизнеспособности МБТ в условиях химиотерапии возможно выявление их во время бактериоскопии, обычно люминесцентной, при отсутствии роста на питательной среде.
На плотных питательных средах рост колоний появляется обычно на 3-й – 4-й неделе, однако отрицательный ответ выдается через 3 месяца, ввиду возможности замедленного роста при снижении жизнеспособности МБТ. В настоящее время большое значение придается не только самому факту выявления МБТ при посеве, но и количественной оценке. По рекомендации Центрального НИИ туберкулеза России оценка проводится по 3-м степеням: скудное – от 1 до 20 колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу видимых колоний, умеренное – 21-100 КОЕ и обильное – более 100 КОЕ. Величина КОЕ рассчитывается как среднее от числа колоний, выросших во всех пробирках.
Определение лекарственной чувствительности МБТ является неотъемлемой частью бактериологического исследования. Обычно вначале из материала получают рост культуры МБТ, затем их засевают на пробирки со средой, содержащей противотуберкулезные препараты. Устойчивость определяется как снижение чувствительности до такой степени, когда данный штамм микобактерий способен размножаться при концентрации в питательной среде препарата на уровне принятого для него критерия устойчивости (критическая концентрация), например, изониазид – 1 мкг/мл, рифампицин – 40 мкг/мл и т.д.
Определяется также видовая принадлежность МБТ : М. tuberculosis или М. bovis и др. при помощи ниацинового теста. Необходимо также идентифицировать атипичные микобактерии.
К классическим методам идентификации микобактерий относятся:
- изучение цвета колоний (фотохромогенность и др.),
- скорость роста, быстрорастущие относятся к атипичным, чаще сапрофитным группам,
- температура – некоторые атипичные микобактерии, например M. kansasii, M. scrofulaceum могут расти и при комнатной температуре, хотя и медленнее, а M. avium-infracellulare и некоторые другие – при 22°, 37°, но также и при 45°.
Большинство нетуберкулезных микобактерий дают рост в виде S- колоний (гладких), тогда как M. tuberculosis и M. bovis – R-колоний (шероховатых), для них нехарактерно наличие кос, жгутов на жидких средах. Ниациновый тест основан на том, что микобактерии человеческого вида выделяют значительно больше никотиновой кислоты (ниацина) чем остальные – 4-17 мкг/мг, в то время как бычьего – всего 0,3-0,9 мкг/мг. Наличие ниацина выявляется с помощью цветной реакции, в том числе на бумажных полосках.
Тест с определением каталазной активности МБТ основан на том, что при прогревании культуры при 68° 30 мин она теряется у туберкулезных и сохраняется у атипичных микобактерий. При этом следует помнить, что устойчивые к изониазиду МБТ исходно теряют каталазную активность.
К современным методам идентификации относятся молекулярно-генетические методы – пробы ДНК и РНК микобактерий, а также метод хроматографии, значительно ускоряющие исследование. Если ниациновый тест занимает до 6 недель, то Gen Probe на РНК или хроматография – 1 рабочий день. В современных условиях определение видовой принадлежности с помощью молекулярно-биологических методов, выявляющих генетические различия, является наиболее быстрым и занимает 1-2 дня.
В настоящее время появились автоматизированные системы для обнаружения МБТ и определения их лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (BACTEC, BBL MG IT MB/Bact System), которые позволяют выявлять рост МБТ и определять чувствительность к противотуберкулезным препаратам в 2-3 раза быстрее классических методов. С этой целью используется радиометрический метод, когда в жидкую питательную среду добавляется меченая 14С пальмитиновая кислота, а выделение микобактериями радиоактивного углерода улавливается специальными датчиками.
Применяется и нерадиологический метод, основанный на поглощении кислорода растущей культурой МБТ. Снижение его концентрации в камере приводит к появлению флюоресценции и свечения в ультрафиолетовых лучах. Реже применяется биологический метод, заключающийся во введении патологического материала морской свинке, высокочувствительной к туберкулезной инфекции.
Современным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на обнаружении специфической ДНК микобактерий туберкулеза и её фрагментов. Расшифровка последовательностей нуклеотидов ДНК дает возможность их идентифицировать. Суть метода заключается в амплификации (клонировании) определенных специфических локусов ДНК микобактерий и выявлении их при помощи синтетических видоспецифических олигонуклеотидов, называемых праймерами. Такие праймеры в настоящее время синтезированы при помощи компьютерной программы.
Обнаруживаются продукты амплификации путем электрофореза при связывании с праймером. Является наиболее чувствительным из существующих методов и позволяет определять 1-10 микобактериальных клеток в 1 мл материала. Специфичность реакции – 97-98%. При помощи ПЦР можно выявить и лекарственную устойчивость. Если традиционными методами лекарственную чувствительность МБТ удается выявить не ранее чем через 1,5-2 месяца, то применение ПЦР позволяет сделать это за несколько (до 2-3) дней.
В настоящее время установлен ряд генов в ДНК МБТ, мутации которых ответственны за развитие устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Выявление этих мутаций производится путем разработки и применения молекулярнобиологических методов. Число обнаруженных мутаций в генах все время увеличивается и исчисляется многими десятками.
Для выявления МБТ и ЛУ к рифампицину и изониазиду используется метод биологических микрочипов (ТБ-Биочип-2004), её можно выявить у части больных, где при посеве на обычные среды бактериовыделение не обнаруживается. Методу, несомненно, принадлежит большое будущее. В настоящее время его применение сдерживается дороговизной, а также получаемыми изредка ложноположительными результатами. В настоящее время разработаны методы выявления L-форм микобактерий туберкулеза – бактериоскопические, культуральные с применением селективных питательных сред и др.
Автор: Маханова Нурия
Областной противотуберкулезный диспансер
Источник