Меню

Посев биологического материала на питательные среды необходим для диагностики инфекций



Классический бактериологический метод

Классический бактериологический метод

04 января 2017

Бактериологический (культуральный) метод исследования заключается в выявлении патогенных микроорганизмов и определении их чувствительности к антибиотикам. Процесс выявления микроорганизмов состоит из нескольких этапов:

  • 1. Посев материала на питательные среды.
  • 2. Получение чистых культур микроорганизмов.
  • 3. Идентификация микроорганизмов.
  • 4. Определение чувствительности к антибиотикам, антимикотиков.

Первый и второй этапы бактериологического исследования одинаковы и для классического, и для автоматического бактериологического методов.

Биологический материал высевают на питательные среды. Для каждого вида биологического материала используется определенный набор питательных сред. Это связано с тем, что в разных видах биологического материала находятся различные виды микроорганизмов и необходимо, чтобы выросли максимально все. Используются питательные среды общего назначения — на них растет подавляющее большинство микроорганизмов — кровяной агар, шоколадный агар; дифференциальные среды — позволяют отличать разные виды микроорганизмов — среда Эндо для энтеробактерий, селективные среды — растут только отдельные виды бактерий — энтерококагар для выявления энтерококков, маннитол-солевой агар для обнаружения стафилококков.

Посев делают таким образом, чтобы получить отдельные изолированные колонии.

Посевы помещают в термостат, как правило, на 24 ч при 37С. Некоторые посевы инкубируют при 28С, а некоторые в течение 48 часов. Посевы для выявления грибов рода Candida до 5 суток, мицелиальных грибов — до 30 суток.

Просматривают посевы на питательных средах. По внешнему виду колоний (размер, цвет, форма), определёнными быстрыми тестами и микроскопией определяют возможный вид микроорганизмов и их значение в конкретном случае. Избранные колонии отсеивают на универсальные питательные среды для накопления чистой культуры микроорганизмов. В случае роста колоний только одного вида можно проводить идентификацию и определение чувствительности без этапа накопления чистой культуры.

В зависимости от вида микроорганизма проводят его идентификацию (определение биохимических и антигенных свойств) с помощью фиксированного набора субстратов и сывороток. Субстратами являются углеводы, аминокислоты и другие сложные соединения. По результатам устанавливают род и вид микроорганизма.

Для установления вида некоторых микроорганизмов может потребоваться серологическая идентификация.

Все среды для идентификации и определения чувствительности к антибиотикам готовятся и стерилизуются отдельно. Такая процедура очень трудоемкая, то есть требует много ручного труда и времени, дополнительного оборудования. Таким образом у данного метода низкий уровень стандартизации.

Для идентификации некоторых требовательных клинически значимых видов микроорганизмов необходимы сложные и дорогие субстраты, которые в рутинной практике трудно готовить и использовать. Из-за этого спектр микроорганизмов, которые можно было бы идентифицировать, сужается по сравнению с возможностями автоматического анализатора.

Определение чувствительности к антибиотикам проводится с учетом результатов идентификации и вида биологического материала.

При использовании классического бактериологического метода, определение чувствительности к антибиотикам происходит диско-диффузным методом. Этот метод базируется на изучении зон задержки роста микроорганизма вокруг бумажного диска, который пропитан антибиотиком. В зависимости от зон задержки роста определяют устойчивые, умеренно-стойкие и чувствительные штаммы микроорганизмов к тому или иному антибиотику. Данный метод является наиболее распространенным для изучения чувствительности, а также дешевым и простым в исполнении. Однако он также плохо поддается стандартизации, поскольку требует много ручного труда.

Кроме того, согласно рекомендациям международных организаций, которые занимаются совершенствованием существующих методик и разработкой новых (EUCAST — Европейский комитет по определению чувствительности к антибиотикам, CLSI — Институт клинических лабораторных стандартов), чувствительность к некоторым антибиотикам НЕЛЬЗЯ определять диско-диффузным методом, поскольку не определены критерии оценки полученных результатов.

  • 1. колистином — кишечная палочка, клебсиелла и другие энтробактерии, синегнойная палочка, ацинетобактер;
  • 2. бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы), гликопептиды (ванкомицин, тейкопланин), даптомицином, фосфомицин – стафилококки;
  • 3. даптомицином — стрептококки групп А, В, С и G;
  • 4. меропенем — пневмококки при менингитах;
  • 5. бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы) – пневмококки.

Кроме того существуют микроорганизмы, чувствительность которых к антибиотикам вообще нельзя определять диско-диффузным методом: Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, все анаэробные микроорганизмы, Helicobacter pylori, Candida spp., Aspergilus spp. и другие мицелиальные грибы.

В настоящее время проведения микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме человека возбудителей инфекционных заболеваний. Классический бактериологический метод исследования решает задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать рациональное лечение этого заболевания.

Преимущества автоматического метода

1. Скорость получения результата. Результат наших исследований является максимально быстрым. Уже на 3 сутки Вы получаете название микроорганизма, который был обнаружен в исследуемом образце, а также его чувствительность к антибиотикам. (!) Срок исследований в автоматическом методе продлен до 5 суток за счет длительного роста грибов рода Candida.

2. Точность. Автоматический анализатор дает возможность быстро и очень точно определить какой именно из 400 микроорганизмов есть в биоматериале.

Читайте также:  Во что лучше садить перцы на рассаду

3. Большой спектр антибиотиков к которым определяется чувствительность позволяет врачу назначить наиболее рациональную антибиотикотерапию с учетом характера заболевания и особенностей пациента. К тому же определение чувствительности таким методом является максимально быстрым и точным по сравнению с классическим.

Важно! В результате микробиологического исследования проведенного автоматическим методом антибиотикочувствительность издается с показателем МИК * (минимальная ингибирующая концентрация)

Источник

Диагностика инфекционных заболеваний

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы специальных лабораторных методов исследования:

  • бактериологические;
  • серологические;
  • метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:

  • микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
  • выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
  • идентификацию бактерий;
  • определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 — стрептококки; 2 — стафилококки; 3 — диплобактерии Фридленда; 4 — пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 часов. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Читайте также:  Лейка для шланга для полива комус

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Идентификация — это комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма. В Лаборатории «Ситилаб» идентификация большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства: на бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в зависимости от выделенного микроорганизма) с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов определения чувствительности к антибактериальным препаратам обозначение R указывает на резистентность, I — умеренную чувствительность, S — чувствительность микроорганизма к данному препарату.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

Читайте также:  Форма огурца для семян

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность — характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген.

Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.

Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.

Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.

Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал — сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущества ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключаются в следующем:

  • возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и материале, получаемом при биопсии;
  • возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
  • возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
  • высокая чувствительность метода; например, чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0 . 10 2 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов — 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0 . 10 5 копий/мл).

Источник